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FAQ
[Haut] 1. Qu'est-ce qu'une micropuce?
[Haut] 2. Comment est-ce que je peux analyser mes données? L'analyse des données d'une micropuce dépend des questions posées lors de l'expérience, du concept expérimental et de la qualité de ces données. Il existe de nombreux logiciels (commerciaux et à source ouverte) et possibilités d'analyse qui peuvent vous aider pour une partie du travail, mais l'utilisation efficace de ces outils ne peut s'effectuer que si vous disposez d'une compréhension complète des principes qui les définissent.
[Haut] 3. Comment est-ce que je peux accéder à la liste des gènes de la lame d'oligonucléotides humains 18 k du CMA? Le CMA fournit un fichier gal qui comporte un numéro d'identification UniGene de tous les gènes sur la lame.
[Haut] 4. Comment est-ce que je peux avoir accès aux spectres de masse à électronébulisation des oligonucléotides utilisés pour fabriquer la lame d'oligonucléotides humains 18 k? Le CMA fournit sur demande un indice de qualité de tous les oligonucléotides utilisé sur la lame.
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5. Les micropuces sont-elles prêtes à utiliser? Les micropuces à oligonucléotides sont actuellement imprimées sur des lames recouvertes d'époxyde. Il est fortement recommandé de bloquer la surface de la lame avant l'hybridation; vous réduirez ainsi grandement le signal de fond.
[Haut] 6. Est-il nécessaire de préhybrider les micropuces avant de les utiliser? Non.
[Haut] 7. Pourquoi y a-t-il des taches de fond sur ma lame? Les taches de fond trouvées sur les lames s'expliquent de plusieurs façons :
Solution :
[Haut] 8. J'observe des signaux sur les taches d'Arabidopsis, alors qu'aucun ARN d'Arabidopsis n'a été ajouté à la réaction de marquage. Pourquoi? Ce phénomène se produit en raison de la liaison non spécifique de la sonde marquée des taches d'Arabidopsis. Ce problème peut survenir sur n'importe quel type de micropuce à ADN, mais il est moins gênant sur les puces à oligonucléotides.
EXPÉRIENCE [Haut] 9. Comment isolez-vous l'ARN total des cellules et tissus? De nombreuses trousses offrent d'excellents résultats en matière d'isolation de l'ARN total des cellules et tissus. Nous utilisons actuellement la trousse RNeasy de Qiagen pour l'isolation de l'ARN total des cellules et le réactif Trizol® de Gibco BRL pour l'isolation de l'ARN total des tissus. [Haut] 10. Quelle est la quantité minimale d'ARN nécessaire pour réaliser une expérience à partir d'une micropuce? Généralement, nous utilisons l'ARN total pour nos expériences. En ce qui concerne notre protocole de marquage direct, nous recommandons d'utiliser au moins 10 µg d'ARN total. La même quantité est requise pour notre protocole indirect, mais nous avons constaté que nous pouvions réduire cette exigence à 5 µg si besoin est, sans perte importante du signal. Toutefois, certains tissus semblent poser problème et requièrent plus d'ARN. [Haut] 11. Existe-t-il un moyen d'utiliser moins de 10 µg d'ARN total pour le marquage? Il est possible d'utiliser des méthodes de marquage avec amplification pour réduire la quantité minimale nécessaire. [Haut] 12. Peut-on encore utiliser une puce non hybridée de plus de deux mois? Bien qu'il soit possible d'entreposer des puces non hybridées pendant plusieurs mois à température ambiante en milieu sec, nous ne recommandons pas d'utiliser des puces plus de huit semaines après leur impression. [Haut] 13. Comment est-ce que je peux sécher mes lames par séchage centrifuge si je n'ai pas d'adaptateur pour ma centrifugeuse? Il existe deux façons de sécher des lames. La première consiste à souffler de l'air comprimé dessus. Nous vous conseillons de placer un filtre de 0,2 µm à l'extrémité du tube afin d'empêcher les particules et l'huile de se déposer sur les lames durant le processus. L'autre méthode consiste à utiliser un tube Falcon de 50 ml au fond duquel on a enfoncé quelques petites feuilles de Kim-Wipe. Placez votre lame à l'intérieur du tube en la maintenant à l'aide de forceps du côté du code à barres. Faites sécher par rotation dans un godet de la taille du tube à 500 tr/min pendant 5 minutes.
[Haut] 14. Combien de temps le signal fluorescent reste-t-il sur la lame? Bien que dans l'idéal vous devriez lire vos lames immédiatement après les avoir lavées et séchées (particulièrement en été ou dans des endroits à fort ozone troposphérique), vous pouvez en effectuer la lecture deux à trois jours plus tard. Veillez à entreposer vos lames hybridées dans l'obscurité, préférablement dans un endroit frais et sec. Vous pouvez également les recouvrir d'un revêtement tel que le DyeSaver de Genisphere pour ralentir la dégradation du marqueur.
[Haut] 15. Comment réduire les taches de fond? Il existe plusieurs façons d'éviter l'apparition de taches de fond. Premièrement, placez du DIG Easy Hyb (ou toute solution d'hybridation que vous utilisez) au fond de votre chambre d'hybridation, afin d'empêcher l'assèchement de la solution et de l'ADNc marqué sur la puce. Ensuite, assurez-vous que vos lavages sont assez rigoureux. Rincez soigneusement vos lames après lavage dans du SDS (ou autre détergent). Les détergents peuvent former des micelles qui piégeront le fluorophore non incorporé.
[Haut] 16. Est-ce que je peux laver mes lames une deuxième fois? Oui, il est possible de laver de nouveau les lames. Cela permet parfois d'enlever les taches de fond en forme de tourbillon produites par un lavage-rinçage incomplet. Cependant, le relavage peut également effacer une partie du signal. Nous vous recommandons fortement de toujours enregistrer l'image avant de relaver la lame (au cas où le signal serait entièrement effacé). La durée du relavage, la température et le tampon de lavage varient d'un utilisateur à l'autre. Nous vous suggérons de commencer avec un relavage de 5 minutes à 50 °C au moyen de 1X SSC avec 0,1 % de SDS (tampon de lavage usuel) au besoin.
[Haut] 17. Est-ce que je peux réutiliser mes lames? Non. Les lames ne peuvent servir qu'à une seule hybridation.
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